COMPARISON OF TECHNIQUES FOR DIAGNOSIS OF MICROFILARIA IN SHEEP IN NINEVEH GOVERNORATE

Assiut University web-site: www.aun.edu.eg

COMPARISON OF TECHNIQUES FOR DIAGNOSIS OF MICROFILARIA IN SHEEP IN NINEVEH GOVERNORATE

E.S. HUSSEIN and S.S. AGHWAN

Department of Microbiology, College of Veterinary Medicine,

University of Mosul, Mosul, Iraq

Received: 18 February 2019;     Accepted: 11 March 2019

مقارنة تقنيات تشخيص اليرقات الخيطية الدقيقة في الضأن في محافظة نينوى

ايناس سعدي حسين ، سرى سالم أغوان

E-mail: laythalkattan@yahoo.com            Assiut University web-site: www.aun.edu.eg

تضمنت هذه الدراسة تشخيص خمج اليرقات الخيطية الدقيقة في الضأن بطرق متعددة الا وهي استخدام طريقة الترکيز وطريقة التصبيغ بصبغة کيمزا والتصبيغ بصبغة الاکردين البرتقالية المتفلورة  في عينات دم الضأن في محافظة نينوى في العراق , حيث تبين من خلال فحص 150 عينة من دم الضأن ان نسبة الخمج الکلية 64 % عند استخدام طريقة الترکيز کما قورنت نتائج هذه التقنية مع نتائج تقنية التصبيغ بصبغة الاکردين البرتقالية وظهرت نسبة الخمج الکلية 83 % بينما بلغت نسبة الخمج بطريقة التصبيغ بصبغة کيمزا 43 % , وخلاصة ما توصلنا اليه ان طريقة التصبيغ بصبغة الاکردين البرتقالية المتفلورة هي اکثر کفاءة من بقية الطرق في تشخيص اليرقات الخيطية الدقيقة فضلا عن ان هذه اول دراسة تشخيصية باستخدام احدى الصبغات المتفلورة (صبغة الاکردين البرتقالية ) لعينات دم الضأن في القطر.

INTRODUCTION

المقدمــــــة

 تستوطن اليرقات الخيطية الدقيقة الفلارية  (Microfilaria) في الانسجة وجهاز الدوران للحيوانات الخمجة وتبدأ دورة حياتها غير المباشرة من الاوعية الدموية بسبب انتقالها بواسطة المفصليات الماصة للدم (المضيف الوسطي) فتحقن هذه اليرقات الخيطية الدقيقة وتنقل الى مجرى الدم وتبدأ بالدوران وتتطور هذه اليرقات الى الطور المعدي فيما بعد (Mohamed, 2016; Taylor; 2016) تتراوح ابعاد اليرقات الخيطية الدقيقة ما بين (5.2X260) مايکرون ومحاطة بغمد (Soulsby ;1986, El-Azazy et al.; 1999) , وان بعض انواع اليرقات الخيطية الدقيقة تظهر في مجرى دم المضيف النهائي نهارا (الظاهرة الدورية النهارية Diurnal) وانواع اخرى تظهر ليلا (الظاهرة الدورية الليلية Nocturnal) (Soulsby,1986) تسبب اليرقات الخيطية الدقيقة Microfilaria مرضا طفيليا خطيرا واسع الانتشار في جميع انحاء العالم ويسمى Filariasis حيث يخمج الطفيلي انواعا مختلفا من المضائف من الحيوانات والطيور والانسان ايضا (Sakla, 2000; Bahnass, 2005). تسبب بعض انواع اليرقات الخيطية الدقيقة موت وهلاکات باعداد کبيرة جـدا للضأن مثـل طفيلي Seteria digitata حيث يسبب لها مـرض کامـري (Kumri) وذلـک يؤدي الى ظهور علامات عصبية posterior paralysis  التي تؤثـر سلبا على حياة الحيوان ثم هـلاکـه بعد فتـرة قصيرة جداً (Bazargani, 2008; Tung, 2003) لذلک ارتأينا اجراء دراسة مقارنة لتقنيات متعددة تستخدم في تشخيص هذا الطفيلي لتحديد نسبة الخمج الکلية بالطفيلي واختبار افضل التقنيات لاستخدامها في تشخيص اليرقات الخيطية الدقيقة.

Corresponding author: Dr. E.S. HUSSEIN

E-mail address: laythalkattan@yahoo.com

Present address: Department of Microbiology, College of Veterinary Medicine, University of Mosul, Mosul, Iraq

MATERIALS AND METHODS

المواد والطرائق

جمعت 150 عينة دم من الضأن من مناطق مختلفة من محافظة نينوى وتراوحت اعمار الحيوانات من عمر (1.5) سنة الى عمر 3 سنوات بواقع 7-5 مل لکل عينة من الوريد الوداجي بأستعمال محاقن بلاستيکية ذات الاستعمال الواحد بعد تعقيم المنطقة بالکحول الاثيلي 70 %  ثم وضعت عينة الدم في انابيب مانعة للتخثر سعة 10مل ثم نقلت العينات وحفظت في الثلاجة بدرجة حرارة 4 ˚م لاجراء الفحوصات المختبرية وتصبيغها بصبغة کيمزا والمثيلين الزرقاء وصبغةالفلورسين المباشرة عليها لاحقا (Foreyt, 2001; Thienpont et al.; 1986).

الفحوصات المختبرية التي تجرى على عينات الدم :

1)   knott`s concentration technique

تعتبر هذه الطريقة من احدى الطرق الخاصة للکشف عن اليرقات الخيطية  الدقيقة (microfilaria) في الدم ,حيث وضع 1 مل من دم العينة مع 9 مل من الفورمالين 3) %) في انبوبة ووضعت الانبوبة في جهاز الطرد المرکزي  (1500 rpm)لمدة خمس دقائق ثم نقوم بنبذ الراشح واخذ الراسب واضيف اليه قطرة من صبغة المثيلين الزرقاء 1% للراسب ثم أخذ قطرة بالماصة ووضعت على شريحة زجاجية ثم وضع الغطاء عليها وفحصها تحت المجهر الضوئي تحت قوة40X , 10X , 4X   (Francoise et al.; 1997).

2)   Giemsa stain

وضعت قطرة من الدم على الشريحة الزجاجية وعملت مسحة دموية خفيفة وترکت لتجف لمدة  3دقائق على الاقل ثم ثبتت بالکحول المثيلي لمدة خمس دقائق وترکت لتجف ثم صبغت بصبغة کيمزا لمدة 45 دقيقة ثم غسلت تحت ماء الحنفية وترکت لتجف وفحصت تحت المجهر الضوئي تحت قوة 40X , 10X , 4X  Francoise) et al. 1997(.

3)   Fluorescein stain (Acridine orange flurochrome) تم عمل نوعين من المسحات الدموية لتصبيغها بصبغة الاکردين البرتقالية المتألقة ومنها:

أ‌- مسحة دموية سميکة

وضع قطرة من الدم (0.5) مل على الشريحة الزجاجية وعملت مسحة دموية سميکة وترکت لتجف لمدة 3 دقائق على الاقل وغسلت الشريحة بالماء المقطروثبتت بالکحول المثيلي لمدة خمس دقائق ووضعت في جار زجاجي معتم فيه صبغة الاکردين البرتقالية المتالقة وترکت لمدة 10 دقائق ثم بعد ذلک غسلت تحت ماء الحنفية ثم ترکت لتجف وفحصت تحت المجهر المتألق تحت قوة X 40 , X 10 , X 4   ضمن مدى  ex. max: 460 nm; em. max: 650 nm (Fumihiko ;1991).

ب‌-  مسحة دموية خفيفة 

  وضع قطرة من الدم على الشريحة الزجاجية وعملت مسحة دموية خفيفة وترکت لتجف لمدة 3 دقائق على الاقل وثبتت بالکحول المثيلي لمدة خمس دقائق ووضعت في جار زجاجي معتم فيها صبغة الاکردين البرتقالية المتألقة لمدة10  دقائق ثم بعد ذلک تغسل تحت ماء الحنفية ثم تترک لتجف ثم وتفحص تحت المجهر المتألق تحت قوة  , X 4 X40 , X 10  ضمن مدى ex. max: 460 nm; em. max: 650 nm  (Fumihiko ;1991).

RESULTS

النتائــج

فحصت (150) عينة دم من الضأن وتراوحت اعمار الحيوانات من عمر (1.5) سنة الى عمر  3سنوات وبلغ عدد العينات الموجبة ((110 عينة وأوضحت نتائج دراسة الفحوصات المختبرية المختلفة لعينات الدم ان خمج الضأن باليرقات الخيطية الدقيقة Microfilaria  اذ بلغت نسبة الخمج 73)%) وتم قياس ابعاد تلک اليرقات حيث بلغ طولها (220-200) مايکرون وعرضها (5-3) مايکرون وتمتاز بشکلها المميز الخيطي الطويل الذي يکون جوفها مليء بالحبيبات (انوية الخلايا) واستخدمت في هذه الدراسة ثلاث طرق للکشف عنها منها استخدام طريقة الترکيز (Knott concentration method) و ظهرت نسبة الخمج فيها64) %) وطريقة التصبيغ بصبغة کيمزا Giemsa stain)) في حين ظهرت نسبة الخمج فيها43)%) , فضلا عن استخدام تقنية التصبيغ بصبغة الاکردين البرتقالية المتفلورة بالمجهر الفلورسين  ( Acridine orange flurochrome )حيث ظهرت أعلى نسبة خمج فيها فقد بلغت 83)%) کما في الاشکال (1 ,2 ,3 ) واجريت المقارنة الاحصائية (Petrie et al.; 2006) بين هذه الطرق الثلاثة وکانت هناک فروقات معنوية بينها وعند مستوى معنوية0.05)  ≥ p ) وکانت افضل الطرق تقنية التصبيغ بصبغة الاکردين البرتقالية المتفلورة تلتها طريقة الترکيز واخيرا وطريقة التصبيغ بصبغة کيمزا وکما موضح في الجدول (1)

شکل (3) يرقة الديدان الخيطية الدقيقة باستخدام طريقة التصبيغ بصبغة الاکردين البرتقالية المتفلورة

 (Acridine orange flurochrome) تحت قوة تکبير40  X

جدول1: يبين عدد العينات ونسبة الخمج لکل طريقة للکشف عن اليرقات الخيطية الدقيقة

DISCUSSION

المناقشة

استخدمت طرائق مختلفة لتشخيص اليرقات الخيطية الدقيقة منها تقنية التصبيغ بصبغة الاکردين البرتقالية المتفلورة ( Acridine orange flurochrome ) حيث سجلت هذه الطريقة اعلى نسبة ايجابية فقد بلغت نسبة الخمج فيها (%83) وتلتها طريقة الترکيز (Knott concentration  method) حيث بلغت نسبة الخمج فيها (%64) واحتلت طريقة التصبيغ بصبغة کيمزا بالمرحلة الثالثة حيث بلغت نسبةالخمج بطريقة التصبيغ(%43)  وقد تعزى الاسباب التي أدت الى ظهور مثل هذه الفروقات في نسب الخمج الى حساسية وکفاءة صبغة الاکردين البرتقالية المتفلورة في تشخيص الطفيليات الدموية Trypanosoma spp.  و  Microfilaria  وBabesia spp. في الانسان والحيوان (Ravindran et al ., 2007; Goldsmid &Rogers,1977)  , واتفقت نتائجنا مع دراسة (2018) Suleiman والتي أکدت على استخدام صبغة الاکردين البرتقالية في صبغ المسحات الدموية الخفيفة للکشف عن طفيلي Babesia spp. لسهولتها وسرعتها اذ لم يتجاوز وقت التصبيغ والفحص (5) دقائق , کذلک توافقت نتائجنا مع نتائج (2015) Yoon et al.والذي اکد على الحساسية العالية التي تمتلکها الصبغة لتشخيص طفيلي Babesia spp. عند قوة تکبير (10X) , کذلک أکد کل من  Mohamed(2012) و(2018) Altay et al. على حساسية صبغة الاکردين البرتقالية , وتم تسجيل الخمج باليرقات الخيطية الدقيقة في مدينة الموصل في الضأن والمعز التي بلغت اعمارها اکثر من 4 سنوات وبنسبة خمج (22.82%) (Butty et al., 2011) وفحصت AL-Lahaibi (2013) الافات المرضية الجلدية للکشف عن اليرقات الخيطية الدقيقة للديدان الفلارية فقد تم تسجيل المايکروفلاريا الجلدية لاول مرة في قطعان الجاموس في مدينة الموصل. سجل کلا من AL-Lahaibi وTaee- (2018)  ALاصابة الجاموس باليرقات الخيطية الدقيقة في مدينة الموصل حيث بلغت نسبة الاصابة الکلية (% 13.2) وقد سجلت اعلى نسبة اصابة في منطقة القبة (% 25) حيث تم تشخيص جنس Onchocerca غير المغمدة في قطعان الجاموس .شخصت Butty et al. (2011) اليرقات الخيطية الدقيقة في عينات دم الضأن والمعز من خلال فحص (250) عينة دم من الضأن و(250) عينة من المعز وسجلت الدراسة نسبة اصابة کلية في الضان (%18.8) وفي المعز(% 22) , کما سجلت Suleiman et al. (2012) الخمج باليرقات الخيطية الدقيقة في الخيول في مدينة الموصل حيث بلغت النسبة الکلية للخمج باليرقـات الخيطيـة الدقيقة والتي تعـود الى جنسSeteria  (% 30.76) وسجلت الباحثـة نسبـة خمج مرتفعـة في انـاث الخيول حيث بلغت (% 54.28)  مع وجود فرق معنوي في نسبة الخمج بين الاناث والذکور .

REFERENCES

المـراجـع

AL-Lahaibi, B.Y.M. and AL-Taee, A.F. (2018): Detection of Microfilaria in Buffaloes in Mosul city, Iraq. J. Falloja. volume 11. no.2

AL-Lahaibi, B.Y.M. (2013): Diagnostic study of Ectoparasites and Blood parasite in Buffalo in Mosul city. Msc Thesis, university of Mosul, College of Veterinary medicine, Mosul, Iraq.

Bahnass, MM. (2005): Studies on filariasis in some farm animals. Msc thesis, faculty of veterinary medicine, zaga zig University.

Bazargani, T.; Eslami, A.; Gholami, GR.; Molai, A.; Ghafart, J. and Ashrafi, J. (2008): Cerebrospinal nematodiasis of Cattle, sheep and goat in Iran. Iranian J parasitology: Vol 3, NO.1, PP. 16-20.

Butty, E.T.; Hasan, M.H. and AL-Taee, A.F. (2011): Diagnostic study of Microfilaria in blood samples of sheep and goats in Mosul city. Bas. J. vet. Res. vol.10, No.2.

EL-Azazy, O.M.E. and Ahmed, Y.F. (1999): Patent infection with Seteria digitate in goat in Saudi arabia: Vet. Parasitol. vol.82, No.2, 31; pp161-166.

Foreyt, W.G. (2001): Veterinary parasitology: reference manual. 5th ed., Iowa state university, press. USA. 8,9.

Francoise Ardoin, Odile Bain; John Cross; Vida Dennis; Mark Eberhard; Robert Lowrie; Sri Oemiijati; Jean Pettithory and Purnomo and Lorenzo savioli (1997): Bench aids for the diagnosis of filarial infections, The World Health Organization, Departement of Epidemiology schoolof Public Health, University of California, Los Angeles, CA, USA.

Fumihiko Kawamoto (1991): Rapid detection of plasmodium by a new thick smear using Fluorescence Microscopy: Direct Staining with Acridine Orange, J. Protozoal Research Center in Japan,   1.27-34.

Petrie, A. and Watson, P. (2006): Statistics for Vet. and Animal Science. Blackwell Publishing.

Sakla, AA. (2000): Parasitological studies on filariasis in Assiut governoate. Assiut Med J; 24(1)      37-46.

Soulsby, E.J.L. (1986): Helminths, arthropods and protozoa of domesticated animals. 7th ed., Philadelphia, Bailliere Tindall, London.

Suleiman, E.G. (2018): Morphological & Molecular study of Babesia spp. & isolation & diagnosis of tick vector in infected cattle in Mosul city, Ph.D. Thesis, University of Mosul, College of Veterinary Medicine, Mosul, Iraq, pp124-126.

Suleiman, E.G. and Al- Iraqi, OM. (2012): Detection of Microfilaria infection in horses in Mosul city. Iraqi J.Vet.Sci.26 NO. 2: 23-26.

Taylor, MA.; Coop, RL. and Wall, RL. (2016): Veterinary Parasitology ,4^th ed, Willey Black well.

Thienpont, D.; Rochette, F. and Vanparijs, O. (1986): Diagnosing helminthiasis through coprological examination. Janssen Foundation Beerse, Belgium.

Tung, Lc.; Lai, Ch.; Ooi, HK.; Yang, CH. and Wang, Js. (2003): Cerebrospinal seteriosis with Seteria marshalli and Seteria digitate infection in cattle. J. Vet Med Sci.; 65(9): 977-983.

Yoon, E.; Vail, E.; Sann, L. and Brass, J. (2015): New staining technique for diagnosising Babesia spp. American J. Clin. Pathol./44supp/ 2, 1: A 288, https://doi.org/10.1093/ajcp