DETECTION OF CHLAMYDIAE BY POLYMERASE CHAIN REACTION IN BULLS SEMEN USED FOR ARTIFICIAL INSEMINATION IN SYRIA

DETECTION OF CHLAMYDIAE BY POLYMERASE CHAIN REACTION IN BULLS SEMEN USED FOR ARTIFICIAL INSEMINATION IN SYRIA

SAMER KAMEL IBRAHIM

Faculty of Veterinary Medicine, Albaath University, Hama, Syria.

 __________________________________________________________________________________________

                                          ABSTRACT

__________________________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________________________

Key words: PCR, Chlamydiae, Semen, Artificial insemination.

__________________________________________________________________________________________

الکشف عن المتدثراتفي السائل المنوي للثيران المستخدمة في التلقيح الصناعي في سورية بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل

سامر کامل إبراهيم

من أجل استبعاد دور الثيران المستخدمة في إنتاج السائل المنوي في الجمهورية العربية السورية لغرض التلقيح الصناعي عند الأبقار في نقل العدوى التناسلية بالمتدثرات (الکلاميديا), فقد تم فحص 45 عينة سائل منوي مأخوذة من ثيران في مرحلة الإنتاج. کما تم فحص 15عينات براز مـن عجول منتخبة مـن أجل التربية لغرض التلقيح الصناعي. تـم فحص العينات باختبار تفاعـل البوليميراز المتسلسل وذـلـک بعـد استخراج قالب الدنـا (templet DNA) من تلک العينات. تم إعادة فحص عينات للسائل المنوى مجمعة من نفس الثيران بعد ستة أشهر بنفس التقنية من أجل التأکد من حالة الثيران. أشارت نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى أن جميع العينات کانت سلبية لوجود أنواع الکلاميديا والکلاميدوفيلا في عينات السائل المنوي للثيران المختبرة. يستنتج من هذه النتائج أن الثيران المستخدمة في التلقيح الصناعي عند الأبقار في سورية لا تلعب دوراً في نقل العدوى التناسلية بالمتدثرات.

الکلمات المفتاحية: تفاعل البوليميراز المتسلسل, المتدثرات, السائل المنوي, التلقيح الصناعي.

INTRODUCTION

المقدمة

تصنف عائلة المتدثرات Chlamydiacea إلى جنسين هما جنس Chlamydia وجنس Chlamydophila. يضم جنس Chlamydophila ستة أنواع وهي المتدثرة الببغائية  C. psittaci والمتدثرة الهرية  C.felis والمتدثرة المجهضة  C. abortus والمتدثرة C. caviae والمتدثـــرة     C. pecorum والمتدثرة الرئوية  C. pneumoniae. أما جنس  Chlamydia فيضم ثلاثة أنواع وهي المتدثرة التراخومية  C. trachomatis والمتدثرة الخنزيرية  C. suisوالمتدثرة C. muridarum وقد تم هذا التقسيم اعتماداً على 16S rRNA و 23S rRNA (OIE, 2008 ) و Everett et al., 1999)).

يترافق داء الکلاميديا (المتدثرات) عند الأبقار مع أمراض عديدة تشمل التهاب الأمعاء والتهاب الرئة والتهاب الملتحمة والتهاب المفاصل. إضافة إلى ذلک فإن العديد من المشاکل التناسلية مثل الإجهاض والتهاب المهبل والتهاب الرحم وانخفاض الخصوبة وتکرار عدد مرات التلقيح تترافق مع العدوى بالکلاميديا (2008 Amin, 2003; Kauffold et al., 2007; Radostitis et al.,1994; Petit et al.,).

عزلت الکلاميديا من الثيران من حالات التهاب البربخ (epididymis) ومن الخصي والغدد الجنسية الملحقة بعد العدوى التجريبية بالکلاميديا الببغائية  .(Storz et al., 1976)وکذلک وجد أن الأبقار التي أعديت تناسلياً بالکلاميديا أصيبت بالتهاب المهبل و/أو التهاب بطانة الرحم (DeGraves et al., 2004 ). وفي هذا السياق فقد ذکر (Radostitis et al., 1994) بأن العدوى التناسلية بالکلاميديا عند الأبقار ممکنة ولکنها نادرة الحدوث.

هناک دراسات قليلة عن وجود الکلاميديا في السائل المنوي عند الثيران, فقد أشار ( Kauffold et al., 2007) في ألمانيا إلى الکشف عن وجود الکلاميديا في 9.2 % من عينات السائل المنوي وکان أکثر الأنواع شيوعاً هو الکلاميدوفيلا الببغائية. وقد کشف (Amin, 2003) عن وجودها في 18 عينة سائل منوي من أصل 120 عينة مختبرة. وقال (Givens and Marley, 2008) أن الکلاميديا تسبب عدوى للقنوات الجنسية للثيران. وأشارت دراسات عديدة إلى الکشف عنها في السائل المنوي لذکور الخنازير (Kauffold et al., 2006; Teankum et al., 2006). من کل ما سبق ونظراً لإمکانية انتقال العدوى التناسلية بأنواع الکلاميديا والکلاميدوفيلا عبر السائل المنوي المعد للتلقيح الصناعي وکذلک من أجل ضمان جودة السائل المنوي المعد للتلقيح الصناعي في سوريا, فقد هدفت هذه الدراسة إلى التقصي عن وجود أنواع الکلاميديا والکلاميدوفيلا في عينات السائل المنوي باستخدام تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل لما تتمتع به هذه التقنية من دقة وحساسية عالية واختصار في الوقت والنفقات.

MATERIALS and METHODS

المواد والطرق المعملية

1- العينات:  أرسلت 45 عينة سائل منوي مجمدة  Cryopreservedمن الثيران وذلک من محطة التلقيح الصناعي في محافظة دمشق التابعة لوزارة الزراعة والإصلاح الزراعي, وهي المحطة الأساسية في سوريا لإنتاج وتوزيع السائل المنوي المخصص للتلقيح الصناعي عند الأبقار. تراوحت أعمار الحيوانات بين 3-7 سنوات. کانت جميع الثيران سليمة إکلينيکياً وخالية من المشاکل التناسلية. وبعد ستة أشهر من الفحص الأول تم إعادة جمع السائل المنوي من تلک الثيران. تم نقل العينات إلى مخابر کلية الطب البيطري في خزان سائل آزوتي. بالنسبة لعينات الروث فقد تم جمعها من المستقيم مباشرة من عجول منتخبة لغرض التلقيح الصناعي ولکنها غير مدربة على جمع السائل المنوي.

2- استخلاص الدنا من عينات السائل المنوي والروث: DNA extraction from semen and fecal samples

تم استخلاص الدنا من عينات السائل المنوي باستخدام عتيدة تجارية محضرة من قبل شرکة QIAGEN الألمانية  (QIAamp® DNA mini Kit, Qiagen, Hilden, Germany) و ذلک حسب توصيات الشرکة المنتجة باتباع بروتوکول عزل الدنا من سوائل البدن باستخدام 200 ميکروليتر من عينة السائل المنوي بعد إذابته(Teankum et al., 2007). أما بالنسبة لعينات الروث فقد تم استخلاص الدنا منها باستخدم عتيدة تجارية خاصة باستخلاص الدنا من الروث  (QIAamp DNA Stool Mini Kit, Qiagen, Hilden, Germany). تم حفظ عينات الدنا في المجمدة عند درجة حرارة -20م◦ لحين إجراء اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل.

3-تفاعل البوليميراز المتسلسل:  Polymerase chain reaction

من أجل الکشف عن الدنا الخاص بالمتدثرات, تم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام عتيدة منتجة من قبل شرکة((WWW.biotype.de Biotyp AG, Dresden , Germaeny. واسم العتيدة (Bactotype® PCR Amplification Kite cat.No. 04-104 (Chamydia sp.)). تحتوي هذه العتيدة على مشرعات (Primers) نوعية لأنواع جنس الکلاميديا والکلاميدوفيلا. تم تحضير مزيج التفاعل حسب توصيات الشرکة المنتجة باستخدام 2.5 ميکروليتر من الدنا (purified DNA) وإضافة وحدة دولية واحدة من أنزيــــــم      Taq DNA polymerase (Takara Ex Taq, Japan). وکانت شروط التفاعل کما يلي: دورة واحدة بدرجة 94م◦ لمدة ثلاث دقائق, و 35 دورة بدرجات حرارة 94 م◦ لمدة 30 ثانية و 60 م◦ لمدة 30 ثانية و 72 م◦ لمدة 30 ثانية ودورة أخيرة بدرجة 72 م◦ لمدة 5 دقائق. أجريت جميع التفاعلات باستخدام المدور الحراري (Techne Tc 512 Thermal cycler). تم الکشف عن نواتج التفاعل بالرحلان الکهربائي في هلامة الأجاروز 2% (Peq gold universal No. 2) والمضاف له صبغة الإثيديوم برومايد بترکيز 1 ميکرغرام/مل في دارئة TBE من شرکة تاکارا اليابانية. بعد الرحلان لمدة ساعـــة وشدة تيار 100 فولت, نقلت هلامة الأجاروز الى نظام التظهير بالأشعـــــة فـــــوق البنفسجيـــــــة           (UVipro Platinum)  (Sambrook and Russell, 2001). تعتبر النتيجة ايجابية في حال وجود أنطقة دنا(DNA Bands) ذات حجم 449 قاعدة آزوتية إضافة إلى وجود أنطقة دنا بحجم 838 قاعدة آزوتية (amplification control) وذلک مقارنةً مع معلم الوزن الجزيئي   (100 bp DNA Ladder, PeqLab) وتعتبر النتيجة سلبية في حال وجود نطاق دنا حجم 838 قاعدة آزوتية فقط. تم استخدام شاهد إيجابي وشاهد سلبي مع کل مجموعة مختبرة.

RESULTS

النتائج

عند فحص 45 عينة دنا مستخلصة من 45 عينة سائل منوي مجمدة مأخوذة من ثيران منتقاة لغرض إنتاج السائل المنوي لغرض التلقيح الصناعي عند الأبقار في سورية, فقد دلت النتائج على أن جميع العينات کانت سلبية باختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل لوجود أنواع جنس الکلاميديا والکلاميدوفيلا. وکذلک کانت عينات الروث المأخوذة من العجول الفتية والمرباة في نفس المحطة سلبية لوجود أنواع جنس الکلاميديا والکلاميدوفيلا. وتوضح الصورة رقم (1) هذه النتائج. وعند إعادة الأختبار بعد ستة أشهر على عينات سائل منوي وروث مأخوذة من نفس الحيوانات في المرة الأولى, فقد کانت نتائج جميع العينات سلبية لوجود أنواع جنس الکلاميديا والکلاميدوفيلا, وتوضح الصورة رقم (2) هذه النتائج. وهذا يدل على أن هذه المحطة خالية من  الإصابة.

الصورة رقم (1): نتائج فحص عينات السائل المنوي والروث , يشير العمودM   إلى معلم الوزن الجزيئي (100 bp DNA Ladder), و تشير الأعمدة 1 حتى 24  إلى عينات سلبية لوجود أنواع الکلاميديا و الکلاميدوفيلا. يشير العمود Cp إلى الشاهد الإيجابي و العمود  Cnإلى الشاهد السلبي.

الصورة رقم (2): نتائج فحص عينات السائل المنوي والروث بعد ستة أشهر من الأختبار الأول , يشير العمودM   إلى معلم الوزن الجزيئي(100 bp DNA Ladder), و تشير الأعمدة 1 حتى 24  إلى عينات سلبية لوجود أنواع الکلاميديا و الکلاميدوفيلا. يشير العمود Cp إلى الشاهد الإيجابي والعمود  Cnإلى الشاهد السلبي.

DISCUSSION

المناقشة

يعتبر التلقيح الصناعي وسيلة هامة جداً في التحسين الوراثي وکذلک في حفظ الصفات الوراثية للحيوانات, ولکنه من جهة أخرى قد يساهم في زيادة خطورة انتقال الأحياء الدقيقة الممرضة بما فيها أنواع الکلاميديا. لذلک من الضروري التأکد من خلو السائل المنوي من مسببات الأمراض التي تنتقل جنسياً قبل استخدامه في التلقيح الصناعي.

دلت نتائج هذه الدراسة على أن جميع العينات المختبرة المأخوذة من الثيران والعجول في محطة التلقيح الصناعي کانت خالية من وجود أنواع الکلاميديا والکلاميدوفيلا, ر وقد تم الأعتماد على تقنية PCR  في هذه الدراسة للتخلص من مشاکل الاختبارات المصلية التي تعطي نتائج من الصعب مناقشتها بسبب وجود مناعة تصالبية بين المتدثرات وباقي الجراثيم سالبة الغرام حيث أن المستضدات المستخدمة هي سکريات شحمية    (Qinn et al.,1999) وکذلک فقد أشار( (Kauffold et al., 2007إلى عدم وجود أي ترابط ما بين نتائج الاختبارات المصلية ونتائج الکشف عن المتدثرات في السائل المنوي لنفس الثيران.

وعـــند مقارنــــة هذه النتائـــج مع نتائج الدراســـات السابقــــة, فقد سجلــــت نسب إصابــــــة أکبر عــــــند الثيـــــــران في تلک الأبحـــــاث فقـــــــد وجـــــــــد             (Kauffold et al., 2007) أن 9.2% من عينات السائل المنوي و 18% من عينات الروث کانت إيجابية لوجود أنواع الکلاميديا والکلاميدوفيلا, مع ملاحظة أن هذه العينات مأخوذة من ستة حظائر من مناطق مختلفة في ألمانيا. وکذلک فقد وجد (Amin, 2003) أن 15% من عينات السائل المنوي تحوي على مستضدات أنواع الکلاميديا والکلاميدوفيلا وقد يکون السبب في ذلک أن الباحث حصل على عيناته من قطعان معروف أن الإصابة موجودة فيها. أما (Teankum et al., 2007) فقد کشف عن وجودها في 6.6% من العينات ولکن کانت الکلاميديا الخنزيرة والمجهضة والببغائية في خمسة عينات والباقي جراثيم شبيهة الکلاميديا. اعتماداً على ما سبق يمکن أن يعزى سبب الاختلاف في النتائج إلى حالة الثيران التي أخذت منها العينات, نظام وأسلوب الإدارة والتربية, المنطقة الجغرافية. جدير بالذکر بان هذه المحطة هي محطة حکومية وهي الوحيدة من نوعها في سوريا والمخولة بإنتاج وتوزيع السائل المنوي, وتربى فيها فقط ذکور الحيوانات وتتبع فيها إجراءات صحية قياسية من حيث فترات الحجر الصحي والتأکد من سلامة الحيوانات قبل دخولها إلى المحطة.

REFERENCES

المراجع

Amin, A.S. (2003): Comparison of Polymerase Chain Reaction and Cell Culture for the Detection of Chlamydophila species in the Semen of Bulls, Buffalo-bulls, and Rams. The Veterinary Journal, 166:    86–92.

De Graves, F.J.; Kim, T.Y.; Jee, J.B.; Schlapp, T.; Hehnen, H.-R. and Kaltenboeck, B. (2004): Reinfection with Chlamydophila abortus by uterine and indirect cohort routes reduces fertility in cattle preexposed to Chlamydophila. Infect. Immun.,72: 2538–2545.

Everett, K.D.E.; Bush, R.M. and Andersen, A.A. (1999): Emended description of the order Chlamydiales, proposal of Parachlamydiaceae fam. nov. and Simkaniaceae fam. nov., each containing one monotypic genus of the family Chlamydiaceae, including a new genus and five new species, and standards for the identification of organisms. Int. J. System. Bact., 49: 415–440.

Givens, M.D. and Marley, M.S.D. (2008): Pathogens that cause infertility of bulls or transmission via semen. Theriogenology, 70: 504–507.

Kauffold, J.; Henning, K.; Bachmann, R.; Hotzel, H. and Melzer, F. (2007): The Prevalence of Chlamydiae of Bulls from Six Bull Studs in Germany. Animal Reproduction Science, 102: 111–121.

Kauffold, J.; Melzer, F.; Henning, K.; Schulze, K.; Leiding, C.; Konrad and Sachse, K. (2006): Prevalence of Chlamydiae in Boars and Semen Used for Artificial Insemination Theriogenology, 65 : 1750–1758.

OIE Terrestrial Manual (2008): Enzootic Abortion of Ewes (ovine chlamydiosis). chapter 2-7-7, P: 1013-1020.

Petit, T.; Spergser, J.; Aurich, J. and Rosengarten, R. (2008): Prevalence of Chlamydiaceae and Mollicutes on the genital mucosa and serological findings in dairy cattle. Veterinary Microbiology, 127: 325–333.

Quinn, P.J.; Carter, M.E.; Marky, B.K. and Carter, G.R. (1998): Clinical Veterinary Microbiology, The chlamydiales, p310-315. Wolf Publishing.

Radostitis, O.M.; Blood, D.C. and Gay, C.C. (1994):Veterinary Medicine:Diseased caused by Chlamydia Psittaci, p.1143.

Sambrook, J. and Russell, D.W. (2001): Molecular Cloning: Alabpratory Manual.(3^rd Ed) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

Storz, J.; Carroll, E.J.; Stephenson, E.H.; Ball, L. and Eugster, A.K. (1976): Urogenital infection and seminal excretion after inoculation of bulls and rams with chlamydiae. Am. J. Vet. Res., 37: 517–520.

Teankum, K.; Pospischil, A.; Janett, F.; Brugnera, E.; Hoelzle, L.E.; Hoelzle, K.; Weilenmann, R.; Zimmermann, D.R.; Gerber, A.; Polkinghorne, A. and Borel, N. (2007): Prevalence of Chlamydiae in Semen and Genital Tracts of Bulls, Rams and Bucks. Theriogenology, 67: 303–310.

Teankum, K.; Pospischil, A.; Janett, F.; Burgi, E.; Brugnera, E.; Hoelzle, K.; Polkinghorne, A.; Weilenmann, R.; Zimmermann, D.R. and Borel, N. (2006): Detection of Chlamydiae in Boar Semen and Genital Tracts. Veterinary Microbiology, 116: 149–157.